《生化危机5》的故事背景设定在 20世纪60年代，主要围绕 奥兹威尔·E·斯宾塞在非洲发现始祖病毒展开。斯宾塞与马库斯等人开始研究这种病毒，而主角 克里斯·雷德菲尔德加入了新的组织BSAA，并被派往沙漠地区调查世界末日计划。在调查过程中，克里斯和他的搭档谢娃发现了斯宾塞发现始祖病毒的地方和该处的地下研究所，并揭露了威斯克利用某种病毒复活并获得了异于常人的力量。威斯克计划将Urobros散播到全世界，克里斯为了阻止他，与之展开了一场大战。最终，在吉尔和乔许的支援下，克里斯和谢娃利用直升机上的火箭筒将威斯克葬身在岩浆中。

故事发生在一片酷热沙漠中的无名小镇上，这个地区发生了类似种族冲突的纷争，居民们情绪激动且各种暴力事件频发。与真实世界中发生种族冲突乃至仇杀的地区一样，这里充满了混乱，社会失去了本来的秩序，正义和邪恶的界限已经变得模糊不清。主人公克里斯就是在这样一个背景下前往这个充满动荡的地区展开调查的。

影片设定在1998年，故事不再是只把焦点集中在爱丽丝这个角色身上，吉尔将在由安布雷拉（Umbrella）制造的僵尸潮的爆发中扮演重要角色。里昂·肯尼迪（Leon Kennedy）也将入主，在《生化危机4》电影中就有大量来自游戏第五代的boss，所以这次再把游戏第四代的第一男主角里昂带入电影版《生化5》也算情理之中。

《生化危机5》的故事以延续一切故事开端的《生化危机》洋房危机10年后为背景，故事舞台搬到了人类发源地非洲。全部。

影片主要讲述了地球正陷入前所未有的绝境，保护伞公司研发的T病毒被恶意散播，使得人类变成活尸互相残杀。当生化人艾莉丝（米拉·乔沃维奇饰）从保护伞的秘密实验室苏醒后，发现自己失去记忆，一连串的意外让她面临真假难辨的困境。背负着人类最后的希望，艾莉丝与过去的伙伴和新盟友艾达（李冰冰饰）跑遍东京、纽约、华盛顿和莫斯科四地，试图找出散播病毒的元凶。她们该如何在天谴大限来临前找出生路，带领人类度过末日浩劫。